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上海遠慕生物科技有限公司

【PCR檢測】病原微生物檢測操作方法
點擊次數(shù):86 更新時間:2024-12-11

多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種模擬天然DNA復(fù)制過程,在體外擴增特異性DNA(或RNA)片段的新技術(shù)。本實驗是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板,然后加入一對人工合成的寡核苷酸引物,引物分別與待擴增DNA片段的兩端互補,經(jīng)55℃低溫退火,引物與模板互補結(jié)合。在72℃條件下,結(jié)合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下,利用反應(yīng)體系中的4種dNTP為原料,按堿基互補配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經(jīng)過20-30個周期后,特異的目的DNA可擴增百萬倍以上。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴增條帶。

PCR方法操作簡便,靈敏度高,可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物及寄生蟲的檢測。

【材料】

1.無菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠

2.10×PCR反應(yīng)緩沖液

3.25mmol dNTP混合液

4.引物1,引物2各50pmol/u1

5.模板DNA

6.5U/ul Taq DNA聚合酶

【儀器】

1.PCR擴增儀

2.電泳儀

3.紫外線分析儀

【方法】

1.在0.5m1EP管中,加入以下成分:

10×PCR反應(yīng)緩沖液5u1

引物1 2ul

引物1 2ul

模板DNA 10u1

dNTP混合液4ul

Taq DNA聚合酶1ul

無菌雙蒸水加至50ul

混勻,加50 ul石蠟油,防止樣品水分蒸發(fā)。

2.將反應(yīng)管置于PCR儀中,94℃變性4min。然后按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min,循環(huán)35次后,72℃延伸10 min。

3.反應(yīng)完成后,取l0ul PCR擴增液,加至2%瓊脂糖凝膠中進行電泳,電壓100V,電泳30~60min后,置紫外線分析儀下觀查擴增結(jié)果。

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